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如何評估共聚焦光學截面厚度
共聚焦顯微鏡用于光學切片比較厚的樣本。直接的問題是：1. 什么是“比較厚的樣本"；2. 光學切片到底有多厚？這兩個問題在一定程度上是相關(guān)的，即假設(shè)一份厚樣本至少比光學切片厚10倍。
生物樣本的厚度可以從10米（整只動物）到10納米（電子顯微鏡的超薄切片制備）。由于共聚焦顯微鏡采用了入射光的方法，樣本本身的尺寸可能有幾厘米或更多，但表面下方的穿透深度取決于材料的不透明度和物鏡的工作距離。這就限制了樣本大小（z方向），只能考慮使用厚度多為幾毫米的樣本。
光學切片的決定因素是衍射極限。根據(jù)各種不同的參數(shù)，共聚焦掃描顯微鏡的真正光學截面厚度可達到約0.5毫米。標準共聚焦應(yīng)用（如組織切片）當中常用的樣本厚度為50 µm以內(nèi)。
3D點擴散函數(shù)（PSF）和半高寬（FWHM）
點擴散函數(shù)通過足夠小的熒光小球生成，通過收集xz剖面圖的強度來加以記錄。上圖顯示了衍射圖中心的強度分布（紅色），并對50%數(shù)值之間的z方向距離進行測量（介于綠色線段之間）。
由光學系統(tǒng)產(chǎn)生的點（光斑）的圖像稱為“點擴散函數(shù)"（PSF）。點擴散函數(shù)描述了來自極小光斑的光在三維空間中的分布。這個衍射模型的中心是一個橢球形，影響著光學分辨率。徑向尺寸決定橫向分辨率，軸向尺寸決定聚焦深度，進而決定切片性能。
對于共聚焦截面切片，其目的在于只傳輸PSF的內(nèi)核部分，即所謂的光學切片。實際上，針孔直徑可控制從內(nèi)核外傳遞的光量。因此，處在衍射模型大小范圍內(nèi)的光學切片很明顯不會出現(xiàn)類似于面包片的鋒利邊緣，但仍然存在著同等扁平斜率的特征。連接強度曲線兩側(cè)50%強度的z距離稱為“半高寬"（FWHM），而按照慣例，用于測量光學切片的厚度。光學切片的性能通常要通過聚焦在鏡面上來進行測量，鏡面用于模擬z方向上無限薄的結(jié)構(gòu)。這種方法相對較容易實現(xiàn)并且可用于檢查共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的性能。從更為現(xiàn)實的角度進行考慮，z切片性能還可以通過熒光小球進行測量（見圖1）。熒光小球能夠在符合現(xiàn)實中熒光成像非相干條件下進行性能測量，因此滿足了生物醫(yī)學科學中的大多數(shù)共聚焦應(yīng)用。反射光模式（鏡面）中受衍射限制的光學切片與熒光模式的切片相比要薄得多。在比較文獻中的圖表時請務(wù)必牢記這一點。
控制光學切片厚度的參數(shù)
在理想條件下，可實現(xiàn)的切片厚度僅取決于光學衍射的限制。
影響大的是波長，主要按比例控制PSF的大小：波長越短，切片越薄。我們可以假設(shè)激發(fā)光的波長有限（而不是發(fā)射光的波長），因為照明區(qū)域外并無發(fā)射光。
第二個參數(shù)是物鏡的光圈（數(shù)值孔徑，NA）：NA越高（信息收集的角度越寬），則光學切片越薄。此外，樣本的折射率會影響軸向分辨率，進而影響到切片性能。圖2給出了切片尺寸與這些參數(shù)的相互關(guān)系。
第三個參數(shù)是探測路徑中的針孔直徑，對于上面給出的公式可假設(shè)其為零。因此，該公式給出了熒光成像的值，當然這只具有理論意義：直徑為零的針孔不會生成明亮的圖像！
圖2：熒光樣本中光學切片受衍射限制的小厚度。針孔直徑假設(shè)為零。真正共聚焦掃描系統(tǒng)中的半高寬（FWHM）。
光學切片厚度的評估關(guān)鍵
數(shù)值孔徑NA對切片厚度有顯著影響。PSF的徑向擴展與NA成線性關(guān)系。因此，對于低NA物鏡，PSF內(nèi)核會拉得極長，而且切片會變得很厚。因此，絕大多數(shù)應(yīng)用中都是用NA>1的浸潤式物鏡，其中xy和z維度的比例大致接近于2倍。按照經(jīng)驗，高NA物鏡z部分分辨率大致為xy的兩倍。
理論上的考慮有助于評估光學系統(tǒng)的性能。實際上，儀器和樣本都會導致計算數(shù)值的偏差。必須仔細校準并操作儀器才能獲得性能。而樣本本身就是分辨率的敵人，尤其是在更深層次成像時。
因此，必須特別注意折射率匹配、適宜和恒定的溫度以及正確的蓋玻片選擇。該理論給出的是經(jīng)驗法則，但樣本和設(shè)置可能會帶來顯著的偏差——因為生物樣本比晶體（或真空）更復(fù)雜，所以偏差通常也不可避免。
參考文獻
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Cox G: Optical Imaging Techniques in Cell Biology. Taylor & Francis, Boca Raton USA (2007).
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