生理學條件下的顯微鏡成像
很多生物樣品都會產(chǎn)生自發(fā)熒光。它的光譜往往很寬，會干擾熒光標記。本應用指南論述了自發(fā)熒光如何作為熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)中的內(nèi)在對比度，從而產(chǎn)生多色圖像。此外還概述了如何將光譜成像與熒光壽命信息相結(jié)合，以區(qū)分進而識別生物樣品中的不同熒光組分。

 
顯微鏡遇見自發(fā)熒光
在熒光顯微鏡觀察中，自發(fā)熒光通常被視為很多生物樣品固有的瑕疵。它往往與內(nèi)源性熒光信號的光譜相重疊，且有時會掩蓋其信號。它可能會導致光譜拆分和熒光強度比率分析定量的困難。自發(fā)熒光通常具有極寬的發(fā)射光譜，這使它在普通的光譜成像中拆分起來非常困難。
但自發(fā)熒光本身也有其優(yōu)點。它是一種內(nèi)在的熒光信號，*自然無需標記。本應用指南旨在通過熒光壽命成像(FLIM)識別幾種自發(fā)熒光成分，并闡述它們在生物醫(yī)學研究中的應用
注：有關FLIM技術的基本原理，請參閱應用指南《FRET with Flim - Quantitative in-vivo Biochemistry》
 
自發(fā)熒光遇見生命科學
大多數(shù)生物樣品含有可引起自發(fā)熒光的生化成分。例如，細胞的氧化還原狀態(tài)反映在其NAD(P)H和flavins的濃度上。前者更適合用IR光源激發(fā)，后者也可以用405 nm激發(fā)。很多結(jié)構(gòu)蛋白（例如膠原蛋白、彈性蛋白和纖原蛋白）都可以得到其熒光壽命圖像。
植物細胞尤其富含大量自發(fā)熒光分子。極為常見的有葉綠素、類胡蘿卜素、多酚等。通常情況下，這些化合物不僅可以提供無標記自發(fā)熒光，還可以提供有關細胞或組織中代謝狀態(tài)或病理狀態(tài)的信息。因此，可以通過FLIM和自發(fā)熒光結(jié)合得出有關細胞功能的結(jié)論。
 
無標記反差
為了說明自發(fā)熒光在生物樣品中的作用，我們將分別考察動物界和植物界的示例。
我們先來看介殼蟲。收集并立即制作這種寄生蟲不同發(fā)育階段的標本。使用10倍物鏡記錄激發(fā)波長為470 nm處自發(fā)熒光的概覽圖像（圖1）。熒光強度圖像FLIM數(shù)據(jù)創(chuàng)建，充分呈現(xiàn)了樣品的結(jié)構(gòu)。此處的強度是每個像素的光子計數(shù)，而非標準強度圖像。熒光強度無法區(qū)分任何自發(fā)熒光種類（圖1A）。這些信息包含熒光壽命圖（圖1B），呈現(xiàn)空間熒光壽命分布，它提供了不同熒光壽命成分的圖像。
就自發(fā)熒光而言，這通常代表不同的分子種類或其組合。我們可以很好地區(qū)分觸角和腿周圍殼多糖化的外骨骼（綠色到藍色）。殼多糖的壽命很短。周圍組織的熒光壽命比較均一接近3 ns（黃色）。某些具有較長壽命（橙色）的區(qū)域可能代表其他物質(zhì)，但在此處，它們更可能代表較暗的區(qū)域，這些區(qū)域在熒光壽命的測量精度較低。
通常作為FLIM圖像感知和傳達的內(nèi)容實際上是強度調(diào)制熒光壽命圖（圖1C）。熒光壽命信息乘以強度圖像。這種再現(xiàn)方式傾向于不強調(diào)光子較少統(tǒng)計較差的較暗區(qū)域，并且保留了強度圖像中包含的更多結(jié)構(gòu)信息。后者通常有助于解釋熒光壽命，例如熒光壽命圖中的橙色區(qū)域。我們可以得出結(jié)論，F(xiàn)LIM能讓我們在不受干擾的情況下識別不同的分子種類并研究其空間相互關系。

 
圖1：介殼蟲的自發(fā)熒光圖像（腹面觀）。強度圖像(A)、熒光壽命圖(B，去背景) 和強度調(diào)制熒光壽命圖像(C)。熒光壽命圖顯示至少三個不同顏色編碼不同熒光壽命，并顯示空間位置信息。長度為1.5 mm，截面厚度為1.3 μm。掃描格式280 x 512，物鏡10x NA 0.4，用470 nm激發(fā)，檢測478 nm至703 nm的發(fā)射（樣品由荷蘭阿姆斯特丹NCI的Kees Jalink提供）。
深度–三維熒光壽命成像
仔細觀察自發(fā)熒光圖像（圖1），我們會發(fā)現(xiàn)觸角外部有藍色區(qū)域，內(nèi)部有綠色區(qū)域。那么，綠色區(qū)域是代表不同的成分，還是殼多糖熒光（藍色編碼）和周圍組織（黃色編碼）的混合？為了解決這個問題，我們可以在較小的區(qū)域上使用較高NA的物鏡。我們還必須考慮圖像的z擴展。為了更好地觀察結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，我們可以記錄FLIM z-stack（圖2）。事實證明，較短的壽命是由殼多糖引起，因為觸角內(nèi)部的熒光壽命與中間切面顯示的周圍組織熒光壽命相同（圖2A，白框）。可以使用z-stack最大投影查看厚的結(jié)構(gòu)（圖2B）。等值面渲染促進了對3D切面結(jié)構(gòu)的更充分了解（圖3）。請注意，關節(jié)不含殼多糖，這在FLIM數(shù)據(jù)中清晰可見。FLIM圖像能看到重要的分類特征，例如散布在所有身體部位的毛狀剛毛，它們顯然含有殼多糖成分。

 
圖2：介殼蟲觸角的FLIM z-stack。使用40x NA 1.25鏡頭(A)記錄了約1 μm深度的40個切面。最大投影顯示了觸角和一些殼多糖化的毛發(fā)(B)。最大投影使用第三方軟件完成。視場為388 x 151 μm。
 

圖3：使用圖2中顯示的層切圖像形成觸角的3D圖像。殼多糖化結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在帶有陰影的等值面渲染中（綠色）與周圍組織的3D圖像重疊顯示。（3D可視化使用外部軟件完成）。
多色自發(fā)熒光
植物中的熒光成像通常會受到多種熒光物質(zhì)的影響，例如葉綠素和多種細胞壁成分以及多種內(nèi)源性色素。在這里，我們利用這些內(nèi)在的自發(fā)熒光團來顯示難以區(qū)分的結(jié)構(gòu)。我們記錄了從百合花中提取的花粉粒（小孢子）的z-stack熒光壽命圖像（圖4）。花粉粒的花藥具有肉眼可見和透射光（未顯示）可見的橙黃色。植物界中此類黃色熒光物質(zhì)的可能的物質(zhì)是類胡蘿卜素。我們獲得了0.5 ns到1.2 ns的熒光壽命。兩個主要物質(zhì)的熒光壽命形成鮮明對比。綠色的是（假定的）管單元的網(wǎng)狀外層，它圍繞著呈現(xiàn)為藍色(0.5 ns)的核心。Z切片顯示該核心未填充壽命較短的物質(zhì)，而是在管細胞周圍形成薄的內(nèi)層（圖4A）。最大投影圖（圖4B）和3D可視化圖（圖4C）有助于清晰顯示兩個層的相對立體結(jié)構(gòu)。

 
圖4：百合（百合花）的小孢子（花粉粒）。使用470 nm激發(fā)的自發(fā)熒光揭示了管細胞外層中兩種結(jié)構(gòu)不同的熒光物質(zhì)。使用20x NA 0.7鏡頭檢測從482 nm到744 nm(A)的發(fā)射熒光，記錄了45個Z軸層面（A）。使用外部軟件(B)進行最大投影，并使用外部軟件(C)進行3D等值面渲染。孢子的縱向延伸為130 μm。